PCR三步法的检测有哪些?三步法与二步法有哪些区别?

日期:2021-10-11 阅读量:
  很多情况我们都常用三步法,保证在72度延伸,但是如果条件很苛刻,我们用两步法能够得到三步法批不到的片段。如果是定量PCR的话,多情况用二步法,因为可以再60度左右既可以退火又可以延伸,因此很多定量PCR仪推荐用两步法。但是如果你想得到更加严谨的数据,三步法用于定量PCR是更准确的。下面和大家介绍关于PCR三步法的检测有哪些?三步法与二步法有哪些区别?的内容,欢迎大家阅读!
 
PCR三步法的检测:
 
  1、DNA变性:(90℃-96℃):双链DNA模板在热作用下,氢键断裂,形成单链DNA
 
  2、退火:(60℃-65℃):系统温度降低,引物与DNA模板结合,形成局部双链。
 
  3、延伸:(70℃-75℃):在Taq酶(在72℃左右,活性最佳)的作用下,以dNTP为原料,从引物的3′端开始以从5′→3′端的方向延伸,合成与模板互补的DNA链。
 
  4、检测:PCR反应扩增出了高的拷贝数,下一步检测就成了关键。荧光素(溴化乙锭,EB)染色凝胶电泳是常用的检测手段。电泳法检测特异性是不太高的,因此引物两聚体等非特异性的杂交体很容易引起误判。但因为其简捷易行,成为了主流检测方法。近年来以荧光探针为代表的检测方法,有逐渐取代电泳法的趋势。
PCR
PCR三步法与二步法有哪些区别?
 
  1、步骤不同:两步法退火和延伸同时在60℃-65℃间进行,以减少一次升降温过程,而三步法则分两次完成。
 
  2、用时不同:两步法减少一次升降温过程,提高了反应速度,用时较短。而三步法则比两步法用时更长。
 
  3、适用条件不同:两步法中,PCR扩增区很短,即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的时间内复制完成。三步法的PCR扩增区则较长,需要降低系统温度,引物与DNA模板结合,形成局部双链。
 
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