PCR的特点以及操作注意事项!

日期:2021-10-25 阅读量:
  聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)是体外合成双链DNA的一种方法,其原理类似于天然DNA的复制过程,其特异性主要依赖于与其目的片段两端互补的特异引物和高特异性的酶。下面要给大家介绍关于PCR的特点以及操作注意事项的内容,欢迎阅读!
 
PCR的特点:
 
  1、灵敏度高
 
  PCR产物的生成呈指数级增长,能够在微克级(pg=10-12)级(μg=-6)量级的初始待测模板可扩展至微克水平。在病毒检测中,PCR可以检测出一百万个细胞中的一个靶细胞,其灵敏度可达3个RFU(空斑形成单位);在细菌学上,PCR的最小检出率是3个细菌。
 
  2、简便、快速
 
  对耐热的DNA聚合酶,一次加入反应液,即在DNA扩增液和水浴中进行变性-退火-延伸反应,扩增反应在2~4小时内完成。扩展产物一般采用电泳法分析,不需要使用同位素,无放射性污染。易于推广。
 
  3、纯度要求低
 
  无需分离病毒、细菌和培养细胞,DNA粗品和RNA都可以作为扩增模板。可以直接使用临床标本,例如血液.体腔液.洗漱液.毛发细胞DNA扩增检测,如活组织等。
PCR
PCR操作的注意事项:
 
  引物是决定PCR反应成败的关键,要确保扩增过程的准确性,高效率,引物设计应遵循以下原则:
 
  在NCBI中,对不同物种的同一基因进行序列分析后,得出具有相同基因的cDNA序列,即为该基因的保守区。
 
  引物长度为15-28bp,长度大于38bp时,可使其退火温度升高,不利于常规Taq酶扩增。
 
  引物的GC含量为40%-60%,Tm值建议在72℃左右。
 
  由于密码子的简化,引物3'端建议避开密码子的第三位(建议是T)
 
  基团的分布不均匀,3'端不超过3个连续的G或C。
 
  引物本身不形成发夹结构,引物设计完毕,要BLAST验证。
 
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