PCR反应以及注意事项!

日期:2021-11-08 阅读量:
  聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)是80年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。该技术是在模板DNA、引物和四种脱氧核糖核苷酸存在下,依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。下面给大家介绍关于PCR反应以及注意事项的内容,欢迎阅读!
 
PCR反应:
 
  RT-PCR有两种做法:条件具备的话可用kit一步法进行;若条件不太好的话可分两步进行逆转录再PCR。但后来发现两步法的结果更加理想,条带特异性强且无拖尾现象,体系更加单一比较利于PCR的进行。
 
  1)按组成配制PCR反应液。
 
  2)PCR反应按条件进行。
 
  补充说明:退火温度:退火温度可根据实际样品进行调整,反应条件可在55℃~65℃范围内讨论。有时可以在更广的范围内(45℃~65℃)讨论条件。延伸时间:延伸时间因目的列长度而异,通常TaKaRaEQS按72℃1kb/min设定延伸时间。循环次数:当CDNA量较少时,循环次数可增加到40~50次。PCR产品可在-20℃冰箱中保存。
 
PCR
 
注意事项:
 
  1.RNA浓度必须在RT前进行测量。逆转录系统对RNA量仍有一定要求,常用500ng或1ug。
 
  2.RT按要求做,一般问题不大。
 
  3.如果PCR过程需要扩展片段,则对前两步要求较高,需要有完整的CDNA,不仅可以改变RNA浓度,还可以解决退火温度。
 
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