PCR引物设计的基本原则

日期:2021-04-13 阅读量:
  PCR反应有5端引物和3端引物两种。在设计引导物时,以DNA单链为基准(通常以信息链为基准),5端引导物与待扩展段5端的小段DNA序列相同,3端引导物与待扩展段3端的小段DNA序列相辅相成。下面为大家介绍一下PCR引物设计的基本原则。
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  1、引物长度:15-30bp,常用于20bp左右。
 
  2、引物碱基:G+C含量为40-60%,G+C扩张效果差,G+C过多容易出现非特殊带。ATGC最好随机分布,避免5个以上的布丁或者磷酸成串排列参考。
 
  3、引物内部不得出现互补序列。
 
  4、两个引物之间不应有互补序列,特别是避免3端的互补重叠。
 
  5、引物与非特异扩张区的序列同源性不得超过70%。引物3¤末端连续8个碱基在扩张区以外不得有完全互补的序列。否则,非特异扩张容易。
 
  6、引物3端碱,特别是最后和倒数第二碱,严格要求配对,最好选择g和c。
 
  7、引物5端可修饰。例如,添加限制酶的位置,引入突变位置,用生物素、荧光物质、地高辛标记,添加其他短序列,包括起始密码子、终止密码子等。
 
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