PCR原料的处理工艺有哪些

一、核酸提取的核心方法

1. 酚-氯仿抽提法
   • 原理：利用裂解液破坏细胞释放核酸，通过酚-氯仿去除蛋白质，乙醇沉淀DNA。
   • 特点：
     • 优点：核酸纯度高，可同时分离DNA和RNA。
     • 缺点：操作繁琐，使用有毒试剂（苯酚、氯仿），RNA易降解，对操作要求高。
   • 适用场景：对纯度要求极高的实验（如基因克隆、测序）。
2. 柱式提取法
   • 原理：核酸在高盐条件下结合硅胶膜，杂质被洗脱，最后用低盐缓冲液洗脱核酸。
   • 特点：
     • 优点：操作简便快速，纯度高，适合PCR、qPCR等下游应用，安全性高（无毒试剂）。
     • 缺点：对低DNA浓度样本回收率可能较低。
   • 适用场景：常规样本（如血液、组织）的快速提取。
3. 磁珠法
   • 原理：表面修饰的磁性微珠与核酸结合，通过磁场分离杂质，最后洗脱核酸。
   • 特点：
     • 优点：高通量、自动化兼容性强，适合大规模样本处理，纯度好，适合高灵敏度检测。
     • 缺点：试剂成本较高。
   • 适用场景：临床诊断、高通量测序等需要大规模处理的场景。

二、样本处理与核酸纯化关键步骤

1. 样本采集与裂解
   • 采集：根据样本类型（血液、组织、细胞等）选择合适方法（如抗凝管采血、无菌拭子采集）。
   • 裂解：使用裂解液（含蛋白酶K、SDS等）破坏细胞或病毒，释放核酸。
2. 结合与洗涤
   • 结合：加入乙醇后，将混合物加载到核酸纯化柱或磁珠中，核酸结合到硅胶膜或磁珠表面。
   • 洗涤：用洗涤缓冲液去除蛋白质、盐类、有机溶剂等杂质。
3. 洗脱与保存
   • 洗脱：用低盐缓冲液（如ddH₂O或TE）洗脱核酸，得到纯净DNA/RNA。
   • 保存：避免反复冻融，防止核酸降解（如RNA需-80℃保存）。

三、质量控制与优化

1. 避免污染
   • 使用无核酸酶的试剂和耗材，操作时戴手套、口罩，避免说话、咳嗽。
   • 设置阴性对照（如无模板对照）监测污染。
2. 保证核酸完整性
   • 提取RNA时避免RNase污染，操作轻柔，避免剧烈震荡。
   • 使用DNase I处理样本中的基因组DNA（如提取RNA时）。
3. 优化提取条件
   • 根据样本类型和实验需求选择合适方法（如低DNA含量样本优先选磁珠法）。
   • 调整裂解时间、洗涤次数等参数以提高回收率和纯度。
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